CHIP实验方法及检测申报模板

二、实验材料

l 紧张试剂

l 紧张仪器及器材

三、实验步骤

1. 组织交联：

a.取1g组织，在液氮中将材料充分研磨；将研磨粉末加入到装有10mlPBS的离心管中，涡旋振荡混匀；

b. 加270ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，摇床孵育10min；

c. 加入500ul 2.5M甘氨酸（终浓度为0.125M）终止交联，摇床孵育5min。

d. 3000g，4，离心5min，用预冷的1X PBS（10ml）洗濯2次，每次用3000g，4，5min离心。
（此样本沉淀可冻存于-80）

2. 胞核制备和染色质碎裂：

a. 将一（e）中的样品在冰上孵育10min，（3000g，4，5min）离心，弃上清；

b. 再用1ml cell swell buffer(1X)重悬，在冰上孵育10min，（5000g，4，5min）离心，弃上清。
；

c. 用200ul SDS lysis buffer重悬，冰上裂解30min，并用枪头奏乐;

d. 再加入800ul CHIP dilution buffer（IP buffer）以稀释SDS，进行超声;( JY92-IIN:30%功率，2s on，24s off，总长5min；间隔3min,重复超声6次)

e. 取30ul超声后的染色质样品，加入120ul 无酶水、6ul 5M NaCl、2l RNAse A（10mg/ml）。
涡旋稠浊，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟;

f. 再加入2 l Proteinase K（20mg/ml），65℃ 下孵育样品过夜;

g. 纯化 DNA;并电泳确认片段主带是否在200~500bp（若片段过长，则增加打断韶光连续优化片段化条件）

3. 抗体结合反应：

a.取40ul作为10%的INPUT，于-80℃冻存备用；取400ul加入目的抗体作为IP组，另取一管400ul加入IgG作为IgG做，4旋转孵育过夜；

b. 每个样品取20ul ProteinA/G磁珠，用1ml IP buffer洗涤，置于磁力架上，弃上清

c. 重复上步骤一次；

d. 把洗涤好的磁珠加入到过夜孵育的抗体-蛋白稠浊物中，4旋转孵育2h；

e. 将样品置于磁力架上，弃上清。
用1 ml 低盐洗涤液到微珠中进行洗涤，4C 下旋转孵育 5 分钟。
再重复洗涤两次，以确保统共进行 3 次低盐洗涤。
；

f. 将样品置于磁力架上，弃上清;用1 ml 高盐洗涤液到微珠中进行洗涤，4C 下旋转孵育 5 分钟；

g. 将样品置于磁力架上，弃上清;用1 ml LiCl洗涤液到微珠中进行洗涤，4C 下旋转孵育 5 分钟；

h. 将样品置于磁力架上，弃上清。
用1 ml TE缓冲液到微珠中进行洗涤, 将样品置于磁力架上，弃上清；

i. 向每份 IP 样品中添加 150 l ChIP 洗脱缓冲液；

j. 65C下孵育30min，并时时震荡，将染色质从Beads 上洗脱下来;

k. 短暂离心网络液体于管底，将样品置于磁力架上，网络上清液于新的EP管中；

l. 取出INPUT，添加IP buffer至150ul；

m. 向所有样品中（包括INPUT），加入6ul 5M NaCl、2l RNAse A（10mg/ml）。
涡旋稠浊，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
;

n. 加入2 l Proteinase K（20mg/ml），65℃ 下孵育样品过夜;

o. 利用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA;

2. qPCR检测：

a. 将Mix在4℃下融解，柔柔地高下颠倒混匀并进行短暂离心。

b. 冰上配制下表中的反应液

c. 将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

d. 采取三步法程序进行反应：

3.实验结果：

a.抗体验证结果：

b. CHIP-qPCR柱状图及PCR产物电泳图：

c.CHIP片段化图：

4、项目内容

广州准期生物技能有限公司成立于2016年，始终以探索科学、做事客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业供应全面、便捷、专业的技能做事和产品。
技能方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技能做事平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表不雅观遗传等多个科研平台。
在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降落了科研本钱。

"大众号：准期生物

关注我们，技能难题一号办理！
！
！