实验分享：怎么判断 ChIP 是不是成功呢？

IP 之后的染色质经由洗脱，解交联，RNase A 和 Protease K 处理，抽提或 DNA 纯化柱回收（这些步骤类似于前面的检测超声效果）就可以得到目的蛋白结合的 DNA。
后续的这些步骤对付有分子生物学根本的人来说并不会存在太大的问题。
须要解释的是，很多刚开始做 ChIP 的新手会以 ChIP 得到的 DNA 总量来判断 ChIP 好坏，这实际上是禁绝确的。

虽然很多测序公司会哀求供应特定量的 ChIP DNA 用于建库，但是 ChIP 得到的 DNA 量跟 ChIP 成功与否没有直接关系，由于很多蛋白的 ChIP 得到的总 DNA 大部分为背景 DNA。
一样平常只有通过 ChIP-qPCR 或 ChIP-PCR 验证才能确定 ChIP 成功与否。

ChIP结果图

如何判断 ChIP 是否成功？这包含了两个层次的问题。

第一，全体实验是否 work？

一样平常来说，不管所用抗体是否是 ChIP 级，首先都要确定抗体是否能做你的 ChIP。
如果是 ChIP 级抗体，就严格遵照产品解释书做，或根据别人文章宣布的方法做。
如果不是 ChIP 级抗体，须要先确定是否可以做 IPIF。
如果可行，那再进一步考试测验是否可以用于 ChIP。
比如可以考试测验根据别人文章宣布的方法来做。
如果没有被宣布过，那就只能去推测可能的结合区域，设计引物去做 qPCR 验证。
如果都不能确定，那只能通过测序判断了。
如果你是新手，可以同时做一个阳性对照 ChIP，比如 RNA pol II 的 ChIP（用于对照转录因子）或 H3K4me3 的 ChIP（用于对照组蛋白润色）。
纵然确定抗体可以用于做 ChIP，但对付目的细胞样本，如果之前没有做过，而且不愿定目的蛋白结合的区域，一样平常也可以用别人宣布过的对照细胞株作为对照，与目的细胞样本同时做 ChIP，确定 ChIP 是否成功。

第二，全体实验是否真的 work？

也便是如何打消假阳性？这就须要做阴性对照。
阴性对照包括阴性对照抗体 IgG 和阴性对照区域（即阴性对照引物）。
阴性对照 IgG 用于打消目的蛋白结合的 DNA 区域是抗体非特异性结合的，区域对照打消目的蛋白结合的 DNA 是背景 DNA。

如何通过 ChIP-qPCR 判断 ChIP 是否成功？

ChIP 成功与否一样平常是通过 ChIP-qPCR 打算富集度的办法来判断的。

一样平常来说，通过 ChIP-qPCR 判断 ChIP 成功与否是通过比较目的蛋白在阳性区域和阴性区域的富集度差异来判断的。
大体上，阳性区域比阴性区域富集度高 4～8 倍以下（也便是 2～3 个 cycles），我们可以认为 ChIP 没有成功；如果在 4～8 倍以上，解释目的蛋白在阳性区域有富集，可以初步认为 ChIP 成功了，但详细还要依蛋白而定。
比如 H3K4me3 的 ChIP，常日阳性区域比阴性区域的富集度要高 100 倍以上才可以认为做的不错，但对付很多与染色质结合不是很紧密的蛋白，比如一些转录因子，可能富集度有 10 倍差异就不错了。
一样平常对付已有宣布的蛋白的 ChIP，可以参考别人的宣布来判断；而对付没有宣布的蛋白 ChIP，一样平常能做出有 4～8 倍以上的差异，就可以初步认为成功了。

详细富集度是怎么打算的呢？举个例子来解释：

用作一个 ChIP 反应的起始样品叫做 Input，比如你用 20 ug 染色质去做一个 ChIP，那你的 Input 便是 20 ug。
在做 ChIP 之前我们一样平常会取出一定比例的 Input 作为对照，我们常日称之为% 的 Input。
如我们一共有 41 ug 的染色质，准备用 20 ug 做一个 H3K4me3 的 ChIP，同时再用 20 ug 做一个 IgG 的对照 ChIP。
末了用剩余的 1 ug 染色质做对照，这 1 ug 的染色质相称于一个 ChIP 反应所用染色质（20 ug）的 5%，我们称之为 5% 的 Input。
那么就说我们用了 5% 的 Input（1 ug/20 ug=0.5%）作为对照。

ChIP 结束之后，将 5% Input DNA，H3K4me3 ChIP DNA 以及 IgG ChIP DNA 纯化之后都溶解到等体积的水、10 mM Tris pH 8.0 或 TE buffer 中。
分别设计目的区域 A，阴性区域 B 和阳性区域 C 的引物。
引物扩增片段大小以小于超声后 DNA 大小为宜（一样平常设计 70～200 bp），由于扩增片段太大，高下游引物结合的模板有可能不是位于同一个 DNA 片段上，导致扩增效率较低，乃至会影响真实富集度。
准备好之后分别用 5% Input，H3K4me3 ChIP，IgG ChIP 的 DNA 作为模板，qPCR 分别扩增 A，B，C 三个区域。
H3K4me3 在任何一个区域的富集都都可以用这个公式打算：5% 2[CT value (Input-H3K4me3)]，同样 IgG 的富集度的打算公式是：5% 2[CT value (Input-IgG)]。

如下表所示：

表 1，CT 值汇总

根据上面的公式推导出富集度如下表格所示：

表 2，富集度汇总

通过打算富集度，我们就可以清楚地知道目的蛋白在感兴趣的 DNA 区域的结合强弱。
确定 ChIP 成功之后可以将样品建库，测序用于全基因组剖析。