EMSA实验方法及检测申报模板

2实验材料

l 紧张试剂

试剂名称

品牌

cat.No

EMSA试剂盒

Ruqi

RQM021

探针

擎科

——

核蛋白抽提试剂盒

碧云天

P0028

40％丙烯酰胺

Servicebio

G2005

Ammonium persulfate

麦克林

A801037

甘油

生工

A100854

TEMED

麦克林

T6023

l 紧张仪器及器材

仪器名称

品牌

cat. No

上海勤翔化学发光成像系统

勤翔

6100

微型垂直电泳槽

上海天能

VE-180

转移电泳槽

上海天能

VE-586

四维旋转稠浊仪

其林贝尔

BE-1100型

数显圆周摇床

SCILOGEX

SLK-O3000-S

PCR 扩增仪

bio.rad

PTC-100

紫外交联仪

新芝

SCIENTZ03-II

细胞超声破碎仪

上海净信

JY92-IIN

电泳仪电源

上海天能

EPS-300

高速冷冻离心机

湘仪

TGL-16

l 探针序列

表1 EMSA探针序列

探针信息

序列

B17 probes wild type

GTGGAGGCTTTTACTCCAAGTTTCGCCCCCAAGGCTCAACATGTAAATAG

B17 wild type

GTGGAGGCTTTTACTCCAAGTTTCGCCCCCAAGGCTCAACATGTAAATAG

B17 Mutant

Agaaagcttagtcttggcttcttctgcagggctgctgctaatttcagaaa

3实验方法

l 蛋白提取

1、 取组织样品 0.5g，液氮充分研磨;

2、 加入 200 L 预冷裂解液，2L PMSF，2L Protease inhibitor cocktail和 2 L DTT，4℃旋转裂解 20 分钟；4℃，16,000 g 离心 10 分钟，弃沉淀，上清为提取液；

3、 BCA 试剂盒测定蛋白质浓度；

4、 稀释至20ug/ul，液氮速冻后，-80℃暂时保存。

l DNA-EMSA 结合反应：

1、 按如下表配制反应体系：

组分

终含量

阴性对照

实验组1

实验组2

实验组3

实验组4

实验组5

突 变 型 冷 竞争反应

野生型冷竞争反应

10结合反应液

1

2ul

2ul

2ul

2ul

2ul

2ul

2ul

2ul

细胞核提取物

——

0

2.5ug

5ug

10ug

15ug

20ug

20ug

20ug

Poly(dI:dC)（1 g /L)

1 g

1ul

1ul

1ul

1ul

1ul

1ul

1ul

1ul

生物素标记的探针（20 fmol/ul)

20 fmol

1ul

1ul

1ul

1ul

1ul

1ul

1ul

1ul

竞争性探针（野生）(4pmol/ul)

4pmol

——

——

——

——

——

——

——

1ul

竞争性探针（突变）(4pmol/ul)

4pmol

——

——

——

——

——

——

1ul

——

补充水至：

——

20

20

20

20

20

20

20

20

2、 混匀后在 PCR 仪上37℃反应 20 分钟，让冷探针优先反应；

3、 然后加入标记好的探针，混匀，在 PCR 仪上 37℃反应 20 分钟。

l 电泳及电转移

1、 加入5 ul Loading buffer（5），混匀后立即上样；

2、 用 0.5TBE 作为电泳液。
按照 150V电压预电泳 60 分钟；

3、 将带正电的尼龙膜放入 0.5TBE 中平衡 10min。
待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。
转膜缓冲液为预冷的 0.5TBE，300mA 转印 30分钟；

l 紫外交联

1、于254 nm 紫外灯进行交联 20 分钟；

l 化学发光反应

1、 交联好的尼龙膜加入适量封闭液，于摇床上孵育20 分钟（65转/min）；

2、 去掉封闭液，加入按1:3000稀释Streptavidin-HRP于摇床上孵育30 分钟（65转/min）；

3、 去掉Streptavidin-HRP，并用10ml的洗涤液漂洗3遍，每遍于摇床上漂洗5min(75转/min);

4、 将膜从洗涤液中取出，轻微吸干上面的液体，放入化学发光仪的载物台上，加入ECL事情液完备覆盖尼龙膜，室温静置2-3 分钟;然后进行旗子暗记采集。

4实验结果

l EMSA结果

l DNA-EMSA 胶的配制：

5％的聚丙烯酰胺凝胶（7ml ）

试剂

体积

TBE buffer (5X)

0.7ml

40%acrylamide/bisacrylamide

0.875 ml

20% 甘油

0.872 mL

10% 过硫酸铵

52 L

TEMED

3.5ul

水

4.5ml

项目内容

广州准期生物技能有限公司成立于2016年，始终以探索科学、做事客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业供应全面、便捷、专业的技能做事和产品。
技能方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技能做事平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表不雅观遗传等多个科研平台。
在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降落了科研本钱。

公众年夜众号：准期生物

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