一文读懂常见电镜制样方法超薄切片

在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技能是最基本、最常用的制备技能。

01取材基本哀求

组织从生物活体取下往后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的浸染，涌现细胞自溶征象。
此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细构造遭受毁坏。
因此，为了使细胞构造尽可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷:

(1).动作迅速，组织从活体取下后应在最短韶光内 (争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。

(2).所取组织的体积要小，一样平常不超过1mm1mm1mm。
也可将组织修成1mm1mm2mm大小长条形。
由于固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。

(3).机器损伤要小，解剖东西应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。

(4).操作最好在低温(0℃~4℃)下进行，以降落酶的活性，防止细胞自溶。

(5).取材部位要准确。

02固定

固定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子构造保持生活状态，并且稳定地固定在它们原来所在的位置上。
固定的方法有物理的和化学的两大类。
物理的方法系采取冰冻、干燥、微波等手段来保持细胞构造；化学的方法是用一定的化学试剂来固定细胞构造。
现常日利用化学方法进行固定，有时用物理-化学双固定。

常用的固定剂

(1)四氧化锇 (osmium tetroxide，)是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对付细胞构造中的蛋白质身分有良好的固定浸染。

(2)戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2)， 戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定浸染，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，永劫光的固定(几周乃至1～2个月)不会使组织变脆。
缺陷是不能保存脂肪，没有电子染色浸染，对细胞膜的显示较差。

(3)组织块固定常规采取戊二醛―锇酸双重固定法。
分预固定和后固定，中间用磷酸缓冲液漂洗。
前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用1%锇酸固定液固定1～2小时，pH7.2～7.4。
固定完毕，用缓冲液漂洗30分钟后进行脱水。

03脱水

为了担保包埋介质完备渗入组织内部，必须事先将组织内的水分去除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
急骤的脱水会引起细胞的紧缩，因此，脱水应梯度进行：70% 丙酮15分钟，80% 丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮20分钟(分二次进行)。
游离细胞可适当缩短脱水韶光。
过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使细胞皱缩变形、超微构造毁坏、同时引起样品发脆，造成切片困难或无法切片。

04浸透和包埋

浸透便是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂，这种包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。
目前常用的包埋剂是环氧树脂(epoxy resin)。

05超薄切片前的准备事情

(1)修块一样平常用手工对包埋块进行修整。
将包埋块夹在特制的夹持器上，放在解剖显微镜下，用锋利的刀片先削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成锥体形。

(2)半薄切片定位利用超薄切片机切厚度为1m-5m的切片，称半薄切片。
将切下的电影用镊子或小毛刷转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温，使切片展平，干燥后经甲苯胺蓝染色，光学显微镜不雅观察定位。
如果半薄切片做得好，比一样平常石蜡切片更能不雅观察到细微构造，效果比石蜡切片要好一些。

半薄切片进行光学显微镜不雅观察的目的：(a) 定位：通过光学显微镜不雅观察，确定所要不雅观察的范围，然后保留要用电镜不雅观察的部分，修去别的部分。
(b)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的比拟不雅观察。
半薄切片定位往后，要对包埋块作进一步的修整。
常日将块的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形(最好是梯形)，每边的长度为0.2 mm～0.3 mm。

06超薄切片

超薄切片需用超薄切片机进行。
根据推进事理不同，将超薄切片机分为两大类：一类是机器推进式切片机，用微动螺旋和微动杠杆来供应眇小推进；另一类是热胀冷缩式切片机，利用金属杆热胀或冷缩时产生的眇小长度变革来供应推进。

超薄切片的步骤包括：(1)安装包埋块；(2)安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的间隔；(4)调节水槽液面高度与灯光位置；(5)调节加热电流及切片速率，切片；(6)将切片捞在有支持膜的载网上。

7.染色

常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅。
染色方法有两种：

1.组织块染色

2.切片染色