揭示不合样品储存前提下淡水微生物群落结构和组装过程的变革

编辑 | 璐璐有话说

——[ 弁言 ]——

微生物群落构造和组装过程的变革受到多种成分的影响，不同的储存条件可能导致微生物群落的失落活、变异和演替，从而影响后续的微生物研究结果的准确性，本次研究中，我们将比较不同储存条件对微生物群落多样性、物种组成和群落组装过程的影响。

实验结果表明，不同储存条件下的微生物群落组装过程存在差异，实验数据揭示了淡水微生物群落构造和组装过程在不同样品储存条件下的变革，为淡水微生物研究供应了主要的实验参考和数据支持。

Ⅰ

——[ PCA主身分剖析 ]——

分别利用引物ArBa4F和515R，以及EK-806F和EK-565R扩增1134S和5S rRNA基因的高变V3区域，在 20 L 体积中进行一式三份 PCR 反应，个中含有 0.2 L BSA、0.4 L FastPfu 聚合酶（AP221-02）、每种引物 0.8L（5 M）、2 L dNTP（2.5 mM）、4L 5FastPfu缓冲液（2.5 单位/L）和10 ng 模板 DNA。

18S扩增子的循环参数包括在95C下初始变3分钟，然后在35C下进行30次95 s的循环，在30C下55 s，在45 C下72 s，在10 C下终极延伸72分钟。

利用相同的PCR程序得到16S扩增子，并设置27个循环的变革，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶可视化，利用2300 bp配对末端测序方法对纯化的PCR产物进行合并和测序。

为了评估随机过程对微生物群落组装的潜在主要性，运用中性群落模型（NCM）来预测OTU的发生频率与其在更广泛的元群落中的相对丰度之间的关系，在该模型中，OTU根据其涌现频率分为三个分区，即更频繁（高于分区），不太频繁（低于分区）和在95%置信区间内（中性分区），个中95%置信区间的打算基于1000个自举重复。

将序列表转换为存在和不存在（0）的二进制矩阵，然后利用SIM9随机化算法进行基于30，000次仿照的C分数打算，燃烧500次迭代中，由不雅观测指数与仿照指数均匀值之差除以仿照指数的标准差来评估，正SES值表示分离，而负SES值表示整体聚合模式。

从1个样本中共得到922，491，1和612，295，45个高质量的原核和真核序列，分别聚拢成3553个和905个OTU，相似度为97%，过滤后，将每个样品罕有到相同的测序深度，每个样品的覆盖率值在0.983至0.998之间，表明大多数微生物分类群已被回收。

在对照组（CN）中，放线菌门丰度最高（测序读数），占细菌总丰度的37.13%（0.40%），其次是变形杆菌（27.474.28%）、拟杆菌（14.731.45%）和蓝藻（10.715.56%）。

放线菌、拟杆菌、氯比菌和厚壁菌的相对丰度随贮藏韶光的增加而降落，而变形杆菌、蓝藻、疣状微生物、绿原菌和扁平菌的相对丰度增加，在属水平上，假单胞菌、分枝杆菌的相对丰度随贮藏韶光的增加而增加。

纤毛门、叶藻门和赭门是对照组中最普遍的真核门，分别占总读57.15.3%、44.2037.5%和93.1651.4%，随着贮藏韶光的增加，赭叶藻和叶藻（衣藻）的相对丰度低落，而赭藻的比例随韶光的增加而增加，在前12 h，尼茨基亚属属外，CO组和UC组所有前15个真核类群的相对丰度无统计学差异。

非度量多维缩放（NMDS）命令在储存12 h或更短韶光内，差异性测试进一步证明了这一点，储存24 h后样品中不雅观察到明显的微生物群落分离。

通过主身分剖析（PCA）进一步研究了可能影响微生物群落的生物因子，表明不同贮藏条件下的微生物群落与不同的分类群干系，12 h内微生物群落紧张与放线菌、纤毛菌和拟杆菌干系。

而与密封容器中保存24 h后样品中的氯柔性菌、蓝藻、扁平菌和疣状微生物干系，变形杆菌可能在无盖样品中保持影响位置。
前两个主身分占微生物群落变异的52.6%（PC34和PC4分别为18.2%和1.2%）。

Ⅱ

——[ NMDS剖析微生物群落 ]——

大多数OTU是CO和UC组中的外围设备，在早期（3-12 h），CO组的模块集线器比例高于UC组，而后者的连接器更多，表明OTU之间的相互浸染发生在封闭盖的样品中，其自身组件内发生的相互浸染更多，而分类群之间的更多联系发生在没有盖子的群体中。

不同存储条件下的前三个梯形分类群（包括模块集线器和连接器），与储存794或5218 h的样品比较，储存12 h的样品中OTU_3和OTU_6的相对丰度显著更高（p < 0.05）。

采取中性群落模型（NCM）和棋盘评分（C评分）量化样品储存对微生物群落组装，随机过程对原核和真核微生物群落的相对贡献在早期（3-12 h）增加，然后随着韶光的推移而减少。

储存24 h后，随机过程在塑造真核微生物群落中的浸染显著降落，CO组真核微生物群削产生频率变革的比例始终略高于UC组，而原核微生物群落则相反，估计的迁移率随贮藏韶光的延长而逐渐降落，CO群落高于UC样品，表明闭盖样品的扩散能力可能更生动。

保持样品冷冻或利用防腐剂被认为是运输过程中样品储存的最佳替代办理方案，但研究表明，在某些情形下，室温储存数日不会强烈影响土壤或粪便样品的整体细菌群落构造。

在低温下储存大量水样品是相称具有寻衅性的，为了全面理解储存条件如何影响水样的全体微生物群落，揭示了在不同储存条件下原核和真核微生物群落随韶光的详细变革。

原核生物和真核生物的多样性估量不会随着储存韶光的增加而增加，由于在样品储存的后期可能无法检测到一些非活性或去世亡物种，与对照组比较，盖子封闭的样品在储存24小时后原核多样性显著增加。

24-144小时组的真核丰富度也明显高于初始群落，贮藏过程中的微环境变革可能有利于部分休眠/珍稀物种的成长，有助于检测24 h后样品中较高的多样性，表明不同环境条件下微生物多样性变革较快。

NMDS剖析表明，微生物群落受盖子闭合和储存韶光的影响，特殊是当样品储存超过12 h，差异性测试进一步表明，如果真核微生物是目标分类群，则应立即（3 h内）处理样品，而在储存12 h后创造原核微生物群削产生了显著变革，这与真核生物对环境变革更敏感的事实同等。

已知不屈均或非特异性PCR扩增效率和每个细胞/个体的差异基因拷贝数是基于PCR的测序技能的固有偏差，不雅观测到的相对丰度变革并不一定反响绝对丰度的真实变革。

进行了一式三份PCR以只管即便减少PCR偏倚效应，PCR偏倚效应应同样适用于特定环境中的所有样品，人们推测密封瓶会产生缺氧环境，不适宜需氧微生物茁壮发展，储存12 h后，低氧生境（CO）中需氧变形杆菌的相对丰度显著低于UC组。

通过许可空气-水界面上的气体交流，为没有盖子储存的样品坚持微好氧环境，这可能会抑制厌氧微生物的成长和繁殖，低氧条件下，CO组集球菌、LD12，这与先前厌氧微生物与氧水平呈负干系的结果同等。

集球菌在贮藏期间的急剧减少可能部分归因于氮或磷的花费和缺少，这可能会进一步影响纤毛动物群落，由于它们的潜在猎物（即小型浮游植物和细菌）的比例可能会随着韶光的推移而减少。

这项研究强调了微生物之间可能的相互浸染对微生物群落模式的影响，共生网络剖析显示蓝藻与其他微生物之间的相互浸染更频繁，这可能是由于蓝藻碎片中溶解的有机物对微生物群落构造的影响。

与贮藏后期比较，蓝藻类群在前12 h，一种阐明是，随着蓝藻的成长，营养物质的花费导致了后期的营养缺少，这反过来又增加了蓝藻类群之间的门际竞争，一旦环境得当，蓝藻的数量将急剧增加，由于大多数蓝藻类群具有相似的生态位。

需氧微生物（例如放线菌、拟杆菌和变形杆菌）之间明显的共生模式，表明需氧微生物在贮藏初期具有较强的正干系关系。

在光芒不敷（CO）的组中，在前12 h储存期间，还不雅观察到两种光合门叶藻门和赭藻门之间存在显著的正干系关系，这提醒我们采样瓶的光透明度也是样品储存的紧张考虑成分，随着韶光变长，氧水平的降落可能会改变需氧微生物之间的种间相互浸染和共生模式。

——[ 结论 ]——

无论贮藏条件如何，淡水样品的真核微生物群落在室温贮藏期间的变革速率都快于细菌群落，对照和处理样品的真核多样性在保存超过3 h之间发生了显著变革，而细菌群落在室温下保存12 h内基本上不受容器状态或储存韶光的影响。

实验结果表明，冷冻保存条件下，微生物群落的组装过程呈现出相对稳定的趋势，物种相对稳定，不同类型的微生物，如细菌、真菌和古细菌等，在不同储存条件下的相应存在差异，研究这些变革的机制和影响成分，将有助于优化样品储存和剖析方法，提高淡水生态系统研究的准确性和可重复性。

巴德，亚尔曼，《低营养海洋水域中浮游微微生物》

切斯特，克拉伦斯，《沉积物毒性试验中微生物群》

泽维尔，摩里斯，《微生物和气候变革》